免疫组化实验步骤

1.    石蜡切片用二甲苯脱蜡。(二甲苯各10min/次，2次)

2.    梯度酒精水化（100%以乙醇，90%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，各5min）后，在蒸馏水中浸泡5分钟。

3.    0.01M PBS（pH=7.4）浸泡5min/次，3次 。

4.     每张切片加1滴或50μl 过氧化酶阻断剂（北京鼎国，DGSP-试剂1），以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。

5.     0.01M PBS（pH7.4）浸泡5min/次，3次。

6.     0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液（CB，pH6.0）微波炉最低档抗原修复10min

7.     每张切片加1 滴或50μl 正常羊非免疫血清，室温下孵育30 分钟，封闭后不洗，吸去多余液体。

8.     每张切片加1 滴或50μl的第一抗体（1：100倍稀释），37℃孵育60分钟。

9.     0.01M PBS浸泡5min/次，3次。

10. 每张切片加1 滴或50μl 生物素标记的第二抗体（生物素标记山羊抗兔IgG，北京鼎国，HF005-1，1：500倍稀释）， 37℃孵育30分钟。

11. 0.01M PBS浸泡5min/次，3次。

12. 每张切片加1滴或50μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1：1000倍稀释，北京鼎国，HD009-1），37℃孵育30分钟。

13. 0.01M PBS 浸泡5min/次，3次。

14. 每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB工作液（北京鼎国，DDAB-002），显微镜下观察5~30分钟。

    15.自来水冲洗，苏木素复染，脱水、中性树胶封固

染色结果的观察

1.  阳性结果应定位在细胞相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：

1）细胞膜：如LCA和CD3、CD20等；

2）细胞质：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；

3）细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。

2.  组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。

3.  染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。

4.  组织切片背景深与下列因素有关：

1）石蜡切片脱蜡不干净；

2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；

3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；

4）抗体不纯；

5）抗体孵育后切片清洗不干净。