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本试剂盒为生物素探针，碱性磷酸酶显色系统试，适用于组织样本（石蜡或冰冻切片）和细胞样本（细胞爬片）的原位杂交检测。

试剂盒组成

杂交检测操作步骤

一）标本预处理

细胞爬片

固定液：4% 多聚甲醛（pH7.4 PBS溶液配制）室温固定30min。0.01M PBS洗3次，5min/次。

渗透液：0.1% Triton X-100（0.1%柠檬酸钠溶液配制）冰浴2-10min。

石蜡组织切片

二甲苯和梯度乙醇100%、95%、75%、50%，常规脱蜡入水。

10-20ug/ml蛋白酶K 37℃孵育5～30min（可根据标本新旧厚薄调整消化时间）。

冰冻组织切片

固定液：4% 多聚甲醛（pH7.4 PBS溶液配制）室温固定30min。0.01M PBS洗3次，5min/次。

渗透液：0.1% Triton X-100（0.1%柠檬酸钠溶液配制）冰浴2-10min。

二）杂交及检测

1、RNA原位杂交

1）新鲜配制0.5% H₂O₂甲醇液室温处理30min，蒸馏水洗3次，3min/次。

2）每片滴加50μl蛋白酶K溶液覆盖标本，37℃孵育10min（可根据切片厚度及组织类型进行适当调整，细胞爬片和冰冻切片此步省略）。

3）0.1M PBS洗3次，3min/次。

4）每张切片上滴加50μl预杂交液于标本上，37～42℃孵育2～4h，不洗，甩去多余液体（湿盒必须保湿）。

5）储存浓度为1ug/ul的地高辛标记探针用DEPC水稀释至20ng/ul后在95℃下变性5min，取出后立即冰浴，再按探针：杂交液为1:9比例混合为探针/杂交液工作液。

6）每张切片加1滴探针/杂交工作液，加盖玻片＊不要留有气泡。

7）将切片放入湿盒中，42℃杂交过夜（杂交时间最长不能超过24小时）（湿盒必须保湿）。

8）37℃水温，梯度SSC洗涤（2×SSC洗涤2次，5min/次；0.5×SSC洗涤2次，15min/次；0.2×SSC洗涤2次，15min/次）。

9）每片滴加封闭液50μl，37℃孵育30min，甩去多余液体，不洗。

10）每片滴加50μl碱性磷酸酶标记链亲和素（AP-SP），37℃孵育60min，0.1M PBS洗3次，3min/次

11）显色（避光）：每片滴加50μl BCIP/NBT工作液50μl，通常显色5～30min。显微镜下观察无背景出现可继续显色，显色结束后，水洗终止。

12）核固红复染1～5min，水洗终止。

13）梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。

2、DNA原位杂交

1）在组织片上滴加1滴DNA探针/杂交工作液，盖上一张盖玻片或Parafilm膜。

2）将上述切片放在烤箱中或加热箱中，95℃条件下8~10min以使DNA变性。

以下步骤同RNA原位杂交7）~13）。

保存和有效期：

4℃保存，1年有效。

为了您的安全和健康，请穿戴实验服和手套操作！